熒光定量PCR是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于測量特定DNA或RNA序列在樣本中的數(shù)量。自20世紀(jì)90年代中期問世以來，qPCR已成為生命科學(xué)研究中重要的工具，尤其在基因表達(dá)分析、基因突變檢測、病原體定量等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。
一、原理
熒光定量PCR基于PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)，通過在PCR反應(yīng)過程中加入熒光染料或特異性探針，實(shí)時監(jiān)測產(chǎn)物量的變化。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，目標(biāo)DNA或RNA序列呈指數(shù)級擴(kuò)增，熒光信號也隨之增強(qiáng)。通過對熒光信號的捕捉和分析，可以精確計(jì)算出目標(biāo)序列的起始拷貝數(shù)。
二、技術(shù)特點(diǎn)
1、高靈敏度：能夠檢測到極低濃度的目標(biāo)序列，甚至單個拷貝。
2、高特異性：通過引物設(shè)計(jì)和探針選擇，可以精確識別目標(biāo)序列，避免非特異性擴(kuò)增。
3、實(shí)時性：在PCR過程中實(shí)時監(jiān)測熒光信號，無需后續(xù)處理即可獲得結(jié)果。
4、定量準(zhǔn)確性：可以對目標(biāo)序列進(jìn)行絕對定量或相對定量，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
5、高通量：可以同時檢測多個目標(biāo)序列，提高實(shí)驗(yàn)效率。
三、實(shí)驗(yàn)流程
1、樣本處理：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求對樣本進(jìn)行預(yù)處理，如DNA/RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄等。
2、引物與探針設(shè)計(jì)：根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針。
3、PCR反應(yīng)體系配制：將引物、探針、熒光染料等試劑加入PCR反應(yīng)體系中。
4、實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增：在熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增，記錄熒光信號變化。
5、數(shù)據(jù)分析：利用軟件對熒光信號進(jìn)行分析，計(jì)算目標(biāo)序列的起始拷貝數(shù)。
四、熒光定量PCR的應(yīng)用
1、基因表達(dá)分析：通過比較不同樣本中特定基因的表達(dá)水平，研究基因在不同條件下的表達(dá)模式。
2、病原體檢測與定量：在病毒、細(xì)菌等病原體檢測中，通過qPCR可以準(zhǔn)確測量病原體載量，評估感染程度和治療效果。
3、基因突變篩查：用于檢測基因突變、基因融合等遺傳變異，為疾病的早期診斷和個性化治療提供依據(jù)。
4、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測：在農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域，用于檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的含量和純度。
5、藥物研發(fā)：在藥物研發(fā)過程中，通過qPCR評估藥物對目標(biāo)基因表達(dá)的影響，為藥物療效和安全性研究提供數(shù)據(jù)支持。
