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    豬偽狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒的操作方法

    更新日期: 2023-09-19
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    病毒DNA的提取:
    1.取出已處理的樣品、陰性對照和陽性對照,分別加入600µL抽提液(用抽提液之前不要晃動,不要吸到上層保護液),用力顛倒10次混勻,12,000rpm離心10min。
    2.取500µL上清置于滅菌離心管中,加入500µL異丙醇,混勻,置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出樣品管,室溫融化,13,000rpm離心15min。
    3.棄上清,沿管壁緩緩加入1mL洗滌液,輕輕旋轉一周后倒掉,將離心管倒扣于吸水紙上1min,再將離心管真空抽干15min或37℃烘干。
    4.用30µL無菌水溶解沉淀,作為模板備用。
    樣品制備:
    1.樣品采集:病死或撲殺的豬,取大腦海馬背側皮層、中腦、腦橋、扁桃體、淋巴結等組織;待檢活豬,用棉拭子取鼻腔分泌物,置于50%甘油生理鹽水中,或用注射器取血5mL,2~8℃保存。(要求送檢病料新鮮,嚴禁反復凍融。)
    2.樣品處理:
    2.1組織樣品的處理:稱取組織0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理鹽水繼續磨至無塊狀物;然后將樣品轉至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心5min,取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
    2.2全血樣品的處理:待血凝后取血清放于離心管中,8000rpm離心5min,取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
    2.3陽性對照的處理:混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
    2.4陰性對照的處理:混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
    PCR:
    1.反應體系:分別取16µLPCR反應液A(用前混勻)、2µLPCR反應液B(用前混勻)和2µL模板DNA,混勻。
    2.反應程序:在PCR儀上運行以下程序:94℃3min;94℃30s、55℃30s、72℃30s,35個循環;72℃延伸10min。
    電泳:
    1.制膠:用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
    2.電泳:待膠凝固后,取5µLPCR擴增產物點樣于瓊脂糖凝膠孔中,以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。
    3.染色:取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL,加入10µL染色液,混勻后將膠浸泡30min,于紫外燈下觀察結果。
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