柱式病毒RNA提取試劑盒

柱式病毒RNA提取試劑盒是在一管式病毒RNAout的基礎上開發的、專門用于 從血清(血漿)等液體樣品中提取微量病毒RNA的產品，它具有下列特點：

1. 操作簡單，整個過程只需要 20 分鐘左右，不需要額外在洗柱液中補加 乙醇。

2. 靈敏度高，通過 RT-PCR 檢測到的終靈敏度可以達到 50 拷貝/mL。

3. 安全無毒。

4. 如果加上病毒離心富集步驟，多可以處理 1.5 mL 液體病毒樣品。

5. 與 RT-PCR 和熒光 RT-PCR 兼容。

6. 價廉物美，性價比遠低于國外同類產品。

7. 適用于各種材料，包括血清、血漿、腦脊液、尿液、糞便、培養細胞上清液等無細胞材料。

1. 如果有 N 個樣品，標記 N+2 個 1.5-2 mL 螺旋蓋塑料離心管，多出的一個為陽性對照，一個為陰性 對照。為避免污染，建議不要使用壓蓋式塑料離心管。在每個管上做 個標記，以在后續操作時區別向心面和離心面。然后各加入 0.2 mL 液體樣品（血清、血漿、尿液、腦脊液、唾液、眼淚等等）。

1.1、 如果是口腔拭子、咽喉拭子等各種拭子樣品，則將拭子放入 0.2mL 自備生理鹽水中擠壓出液體，然后取 0.2mL 進行提取。

1.2、 如果是糞便等半固定樣品，則取約 0.3mL 的樣品，加入 0,3 自備生理鹽水，震蕩重懸，離心取 0.2mL 上清進行提取。

1.3、 如果血液，細胞培養液等含細胞的液體，可以離心用上清，也可以直接取用，但后者提取的 RNA 中有細胞的基因組 DNA 污 染。血漿的抗凝劑必須是 EDTA 或 ACD，不能是肝素。使用 ACD 時由于所加入 ACD 會增加體積，樣品會被稀釋，得到的 病毒滴度會比使用 EDTA 低 15%左右。血漿按 0.6mL/ 管的量分裝保存，以避免反復凍融。

1.4、 如果樣品是實體組織或培養細胞，則需要在自備生理鹽水中勻漿后離心，用 0.2mL 上清液（含病毒）進行提取，但此種情 況下后得到的 RNA 不可避免的會含有基因組 DNA 污染。

1.5、 如果液體樣品中的病毒需要富集，可以使用 1.5 mL 上述方法得到的液體在 4℃ 24,000 g 冷凍離心 60 分鐘, 移棄 1.3 mL、 用剩下的 0.2mL 繼續操作。 

2. 加入 0.6 mL RNA 病毒裂解液，振蕩 30 秒混勻后室溫放置 10 分鐘。 注意：RNA 病毒裂解液在 4℃放置后可能會產生沉淀，使用前必須放在 65℃水浴使沉淀*溶解并充分搖勻后再取用。

3. 加入 0.8mL 上柱結合液到離心管中，顛倒混勻后轉移一半的混合液 （0.8 mL）到離心吸附柱中，室溫放置 2 分鐘。

4. 12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘，棄收集管中的穿透液，把離心吸附柱 放回到收集管中。

5. 將剩余的另外一半裂解液（0.8mL）轉移到離心吸附柱中，室溫放置 2 分鐘。

6. 12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘，棄收集管中的穿透液，把離心吸附柱 放回到收集管中。

7. 加入 0.7 mL 通用洗柱液到離心吸附柱中，12,000 rmp 室溫離心 1 分鐘，棄收集管中的穿透液，把離心吸附柱放回到收集管中。

8. 加入 0.3 mL 通用洗柱液到離心吸附柱中，12,000 rmp 室溫離心 1 分鐘，棄收集管中的穿透液，把離心吸附柱放回到收集管中。此為第 二次洗滌，可以跳過。

9. 12000 g 室溫離心半分鐘。

10. 在離心吸附柱的濾膜的中部加入 30-100 uL RNA 洗脫液，然后將離心吸附柱套入一新的 1.5 mL 離心管中，室溫放置 2 分鐘。

11. 12000 g 室溫離心 1 分鐘，離心管中收集的樣品即為 RNA。

12. RNA 樣品可以直接用于 RT-PCR 或逆轉錄反應，也可放-80℃長期保存。

柱式病毒RNA提取試劑盒