病毒RNA提取純化試劑

病毒RNA提取純化試劑是于血清(血漿)等液體樣品中提取病毒 RNA 的純化試劑。本產(chǎn)品回 收率*,尤其適合于整合到臨床 RT-PCR 檢測(cè)試劑盒中。且能用于提取其他液體樣 品和微量樣品。

1. 適用于血清、血漿、尿液、腦脊液、唾液、眼淚等液體樣品。

2. 回收率達(dá)到 90%以上，高于絕大部分基于離心柱的提取方法。

3. 靈敏度高，RT-PCR 檢測(cè)到的終靈敏度可以達(dá)到 50-100 拷貝/mL(對(duì) HIV 和 HCV)。

4. 一管式操作，不使用離心柱，整個(gè)操作過程均在室溫下完成。

5. 無毒環(huán)保。

6. 可放量，如果加上病毒離心富集步驟，每管多可以處理 1.5 mL 液體樣品。

常溫運(yùn)輸，4℃保存，有效期一年。 

1. 如果有 N 個(gè)樣品，標(biāo)記 N+2 個(gè) 1.5-2 mL 螺旋蓋塑料離心管(如 Sarstedt CAT#:782.694.006)，多出的一個(gè)為陽性對(duì)照，一個(gè)為陰性對(duì)照。為避免污染， 建議不要使用壓蓋式塑料離心管。在每個(gè)管上做個(gè)標(biāo)記，以在后續(xù)操作時(shí)區(qū)別向 心面和離心面。

2. 在離心管中分別加入 0.2 mL 液體樣品（血清、血漿、尿液、腦脊液、唾液、眼 淚等等），陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.1、 如果是口腔拭子、咽喉拭子等各種拭子樣品，則將拭子放入 0.2mL 自 備生理鹽水中擠壓出液體，然后取 0.2mL 進(jìn)行提取。

1.2、 如果是糞便等半固定樣品，則取約 0.3mL 的樣品，加入 0,3 自備生理 鹽水，震蕩重懸，離心取 0.2mL 上清進(jìn)行提取。

1.3、 如果血液，細(xì)胞培養(yǎng)液等含細(xì)胞的液體，可以離心用上清，也可以直接 取用，但后者提取的 RNA 中有細(xì)胞的基因組 DNA 污染。血漿的抗凝劑 必須是 EDTA 或 ACD，不能是肝素。使用 ACD 時(shí)由于所加入 ACD 會(huì) 增加體積，樣品會(huì)被稀釋，得到的病毒滴度會(huì)比使用 EDTA 低 15%左 右。血漿按 0.6mL/管的量分裝保存，以避免反復(fù)凍融。

1.4、 如果樣品是實(shí)體組織或培養(yǎng)細(xì)胞，則需要在自備生理鹽水中勻漿后離心，用 0.2mL 上清液（含病毒）進(jìn)行提取，但此種情況下后得到的 RNA 不可避免的會(huì)含有基因組 DNA 污染。

1.5、 如果液體樣品中的病毒需要富集，可以使用 1.5 mL 上述方法得到的液體在 4℃ 24,000 g 冷凍離心 60 分鐘, 移棄 1.3 mL、用剩下的 0.2mL 繼續(xù)操作。

3. 在每個(gè)離心管中加入 0.6 mL RNA 病毒裂解液。RNA 病毒裂解液在低溫放置會(huì) 產(chǎn)生結(jié)晶沉淀，需提前 65℃水浴溶解并充分搖勻后取用。

4. 室溫放置 10 分鐘裂解病毒。

5. 振蕩數(shù)秒后加入 0.7 mL 室溫異丙醇，旋緊蓋后振蕩 30 秒混勻，把離心管的向 心面對(duì)向轉(zhuǎn)頭的中央，13,000-15,000 g 室溫離心至少 15 分鐘。

6. 小心移棄上清，注意不要觸及管底和管壁離心面的 RNA 沉淀（此時(shí)可能看不見）。

7. 加入 1.0 mL 室溫 70%乙醇, 振蕩數(shù)秒后 15,000 g 室溫離心 5 分鐘。注意： 在離心機(jī)中放置離心管時(shí)將其向心面對(duì)向轉(zhuǎn)頭的中央。

8. 小心移棄上清，注意不要觸及管底和管壁離心面的 RNA 沉淀（此時(shí)呈膜狀沉淀）。

9. 再短暫離心數(shù)秒, 用移液器移棄殘留液體（70%乙醇），否則它會(huì)影響后續(xù)反應(yīng)。

10. 加入 200 μl RNase-free 水或1×液相 RNase Erasol(能滅活殘留 的 RNase, 而 RNase-free 水無此功能)，用移液槍仔細(xì)吹打離心管管底和管壁 離心面的膜狀 RNA 沉淀，溶液將呈混濁狀,含少量不溶物。由于不溶沉淀物中含 有 RNA，所以不要離心后取上清使用，必須取混合液使用，哪怕很渾濁。

11. 直接取適量用于 RT-PCR，如果溶于200 uL水,同時(shí)樣品使用量不超過 RT-PCR 體系的 1/2，不溶物一般不會(huì)影響 RT-PCR。剩余樣品可以室溫放置 2 小時(shí)， 也可保存于-80℃保存一個(gè)月。 

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